Los nitrofuranos y los fenicoles son una clase de antibióticos de amplio espectro que se usan ampliamente para matar o ralentizar el crecimiento de bacterias en la industria de la acuicultura. El uso de nitrofuranos y sus metabolitos ha sido prohibido por varios países y organizaciones dentro de la Unión Europea, Estados Unidos y China, debido a sus efectos secundarios nocivos para la salud humana.

  Los nitrofuranos se han definido como medicamentos prohibidos de Clase A en muchos países, y se ha establecido un Límite Mínimo de Rendimiento Requerido (MRPL) de 1.0 µg / kg para alimentos, así como productos animales y acuícolas. La Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) ha establecido un nivel de tolerancia cero para el uso de cloranfenicol en animales, como resultado de sus posibles efectos secundarios en humanos, por ejemplo, anomalías hematológicas, anemia aplásica, etc., que se conoce que son causadas en humanos. expuesto a la ingestión de productos alimenticios que contienen residuos de este medicamento.

En estudios anteriores, se demostró que los nitrofuranos se transforman rápidamente en metabolitos que se unen fácilmente a los tejidos proteicos. Los metabolitos unidos son muy estables y se utilizan como un indicador de residuos de nitrofurano en diversos productos alimenticios, animales y acuáticos. Los nitrofuranos más utilizados y sus metabolitos son la furazolidona como 3-amino-2-oxazolidinona (AOZ), la nitrofurazona como la semicarbazida (SEM), la furaltadona como 3-amino5-morfolinometil-2-oxazolidinona (AMOZ) y la nitrofurantoína como 1-aminohydantoin (1-aminohydantoin (1-aminohydantoin) AHD).

En los países en desarrollo, el uso de medicamentos veterinarios es frecuente en la cría intensiva de camarones marinos para lograr una producción sostenible. Los rechazos de envíos por parte de los países importadores han sido recurrentes en los últimos años debido a la detección de estos antibióticos prohibidos. Los requisitos cada vez más complejos para el aseguramiento y la trazabilidad de la seguridad alimentaria establecidos por los principales mercados de exportación exigen la detección de residuos de medicamentos en la industria de la acuicultura.

Método de Extracción Simultánea de Muestras 5 en 1

Los ensayos ELISA se utilizan ampliamente para la detección de metabolitos de nitrofurano y cloranfenicol para la conformidad reguladora, debido a la alta sensibilidad, selectividad y facilidad de uso del método. En el siguiente estudio, demostramos la exactitud y precisión (estudio de validación CCβ) del Método de Extracción Simultánea de Muestras 5 en 1 mediante métodos de automatización ELISA y DS2 manuales. La sensibilidad de los kits de ensayo (LOD) también se demostró utilizando el Método Manual y DS2. Finalmente, se realizaron pruebas de variabilidad de la muestra para caracterizar los efectos de la matriz de varias fuentes de camarones.

Experimental 
Materiales y Métodos

Se utilizó el método de extracción de muestras 5 en 1 mediante el uso de reactivos de extracción orgánicos junto con los reactivos suministrados por los kits MaxSignal HTS ELISA (AOZ, AMOZ, AHD, SEM y CAP). Se utilizó un procedimiento especial para extraer los cinco analitos de una sola muestra de camarones. Los extractos se usaron junto con los componentes del inmunoensayo enzimático de los ELISA kits MaxSignal® HTS para determinar la concentración de los cuatro nitrofuranos y los CAP.

El Laboratorio Automático DS2 (ELISA) de Dynex Technologies, una plataforma de automatización de dos placas con capacidades automáticas de reducción de datos, se utilizó para el análisis de las muestras.   Las muestras de camarones (especies de Vannemei) y las variedades de la costa del golfo se obtuvieron de los mercados locales y se analizaron previamente mediante métodos LCMS-MS para detectar contaminación endógena. Los picos de metabolitos y los estándares derivados se obtuvieron de SIGMA y son de grado VETRENAL.

Laboratorio Automático DS2 (ELISA)

 

Resultados y Discusión
Sensibilidad (LOD)

El LOD se estableció utilizando matrices de muestra en blanco. Se usó una media de diez réplicas de muestras en blanco para la medición de LD. El LOD de un método se define como la concentración más baja que se puede medir de manera confiable. El LOD se define como la media + 3 * StDev informada para las muestras negativas / blanco. Los resultados de los estudios LOD que utilizan los métodos ELISA y DS2 manuales se representan en la Tabla 1.

 La Tabla 1 representa los resultados de las determinaciones de LOD.

Se observó que el método 5 en 1 eleva ligeramente el fondo en las muestras CAP. Este fue un artefacto creado debido al mayor factor de dilución (2) en comparación con el método de extracción de analito único anterior en CAP (0.5). Esto no será un riesgo para los clientes con respecto a la exportación, ya que el LOD reportado todavía está por debajo del límite regulatorio para CAP (0.3 ppb).

Exactitud y precisión

La validación CCβ se realizó para demostrar la exactitud y precisión de los ELISA kits  MaxSignal® HTS de la siguiente manera:

a)    Se procesaron 20 réplicas de muestra de blanco y spike a la mitad del LMR para nitrofuranos (0,5 ppb) y 0,15 ppb para Cap siguiendo el método de extracción 5 en 1
b)    Se utilizaron extractos de muestra para ensayos ELISA por métodos de automatización manuales y DS2
c)    Se verificó la precisión de las recuperaciones de la muestra (rango de recuperación del 60-140%)
d)    Se usó un límite de confianza del 95% (19 de 20 muestras) para mediciones de precisión, o se verificó que las muestras se solapen entre la recuperación de pico más baja y el valor de blanco más alto.

Los resultados de las validaciones de CCβ se resumen en la Tabla 2. Los resultados demostraron una buena exactitud y precisión para el método 5 en 1, tanto con el método manual como con el método DS2. No hubo solapamiento entre el pico más bajo y las muestras en blanco más altas, lo que indica un CCβ exitoso.

La Tabla 2 resume la exactitud y resultados de precisión.

 

Método de Comparación

Se comparó el rendimiento del método ELISA manual y el método de automatización DS2 para establecer el rendimiento del análisis DS2. El diseño de validación descrito en los estudios de exactitud y precisión fue adoptado para este propósito. Se estableció una variación de <20% como buena correlación entre el método manual y el método de automatización DS2. La variación se calculó como la diferencia entre la recuperación media de picos entre los métodos en comparación con el método manual.

Los resultados indican una buena correlación entre el método manual establecido de ELISA y el método de automatización DS2. Los resultados de la correlación se resumen en la Tabla 3.

La Tabla 3 demuestra una buena correlación entre ELISA manual y los Métodos DS2.

 

Variabilidad de la Muestra / Interferencia de la Matriz

Se utilizaron dos tipos de matrices: camarones de la costa del golfo (capturados en la naturaleza en EE. UU.) y Litopenaeus vannamei (cultivados comercialmente en las regiones de India y APAC) para realizar pruebas con el fin de verificar la variabilidad e interferencia de la matriz. Se procesaron cinco réplicas de muestras de camarones de las dos fuentes y se realizó la extracción de la muestra siguiendo el método 5 en 1. Los extractos de muestra fueron analizados por el método de automatización DS2.

Los resultados no mostraron diferencias significativas (<10%) entre las dos fuentes de muestras de camarones, lo que demuestra que la matriz no tiene ningún efecto sobre el método. Los resultados se resumen en la Tabla 4.

La Tabla 4 resume los resultados de las pruebas de variabilidad de la muestra.

 

Conclusión 
Materiales y Métodos

Los ensayos ELISA kits de nitrofuranos y cloranfenicol de MaxSignal HTS están diseñados y desarrollados específicamente para la industria de la acuicultura, entregando un método de preparación de muestras 5 en 1 simple, simultáneo para nitrofuranos AOZ, AMOZ, SEM y AHD, así como el cloranfenicol. Esto acelera las pruebas y reduce los riesgos de contaminación cruzada a la vez que requiere menos reactivos y se logra un tiempo técnico más práctico.

Cuando se usa con el ELISA de Laboratorio Automatizado DS2, el análisis se automatiza y proporciona resultados altamente precisos y consistentes que permiten decisiones más rápidas e informadas para los lotes de mariscos entrantes. Finalmente, el escáner integrado de código de barras brinda una excelente trazabilidad de la muestra y los datos se pueden vincular fácilmente al LIMS para registrar y compartir resultados sin problemas.

Autor: Swapna Gone, Ph.D. Clay Knight -PerkinElmer, Inc. Austin, TX
Fuente: International Aquafeed

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